Иконка «Поделиться»
Иконка ВК в формате SVGИконка Одноклассники в формате SVGИконка Telegram в формате SVGИконка WhatsApp в формате SVGИконка копирования

Популярно о передовых методах документации гелей и блотов

13.01.2021
Иконка глаза в формате SVG 344
5
1

Практика показывает, что в нашей стране многие ученые, до сих пор, снимают результаты Вестерн-блотов по старинке, дедовскими способами, т.е.:

  1. Блокирующие, отмывочные и гибридизационные растворы готовят самостоятельно, из реактивов различной степени чистоты, от самых разнообразных производителей, которые, при этом, очень часто меняются.
  2. Активно применяют вторичные антитела, сшитые с пероксидазой, и ECL-субстраты, самой разнообразной степени активности, от самых разнообразных производителей, которые также, очень часто меняются. При этом, крайне трудоемкая, раститровка антител и субстратов производится далеко не всегда.
  3. Изображения блотов получают, в лучшем случае, с помощью документационных систем, с цифровыми камерами не самого высокого качества. А, зачастую, и вовсе – используют фотопленку в отдельной оборудованной темной комнате, тратя ежегодно большое количество денег на содержание последней и на закупку реагентов (проявитель, фиксаж и т.д.).

Процессы проявки очень растянуты по времени и крайне трудозатратны. И, при этом, можно рассчитывать разве что на качественный или полуколичественный, но ни как не на истинный количественный, анализ блотов. При попытках сделать более или менее количественную оценку результатов, экспериментатор сталкивается с массой проблем, основная из которых – непостоянство ферментативной активности пероксидазы. Активность пероксидазы не является линейной, а описывается сложной функцией, зависящей от большого количества самых разнообразных факторов. Из-за этого, для количественной оценки результатов, приходится строить калибровочные кривые. При этом, вследствие эффектов насыщения, у данных калибровочных кривых, линейный диапазон крайне не широк, 1 – 2 порядка.

Кроме того, сигналы высокой интенсивности, зачастую, полностью маскируют сигналы меньшей интенсивности, а, чтобы надежно засечь несколько различных сигналов, приходится резать мембраны или проводить многократные процедуры отмывки и повторной гибридизации. При большом же скоплении вторичных антител (часто бывает при большом скоплении целевого белка), субстрат локально выгорает, прежде чем вы успеете засечь сигнал. Как результат, появляется белый (выгоревший) участок в центре полосы. Соответственно, о количественной оценке данного сигнала можно забыть.

Ввиду сложности количественной оценки Вестерн-блотов, концентрации целевых белков аппроксимируют по содержанию матричных РНК в препаратах, переводя их в кДНК и ставя количественные ПЦР в реальном времени.

Но, на самом деле, данная техника также далека от идеала, т.к. содержание матричных РНК отнюдь не прямопропорционально концентрациям целевых белков. Кроме того, РНК – гораздо менее стабильная субстанция, по сравнению с белком, и в процессе пробоподготовки, при проведении количественных ПЦР в реальном времени, неизбежно накапливается ошибка. Причем, ввиду сложной функциональной зависимости, величину данной ошибки очень определить практически не возможно.

Между тем, в последнее время, активно развивается технология детекции результатов Вестерн-блотов на основе флуоресценции. В данном случае, вторичные антитела сшивают не с пероксидазой, а с флуорофором, дающим свечение при возбуждении светом определенной длины волны. Такой подход позволяет существенно расширить возможности количественной оценки результатов, т.к.:

  1. В данном случае светимость имеет четкую линейную зависимость от концентрации.
    Четкая линейная зависимость светимости от концентрации
  2. Такая линейная зависимость сохраняется на протяжении 5-6 порядков, по сравнению с 2-я порядками, как в случае хемилюминесценции.
  3. Отсутствуют эффекты насыщения и угасания полос.
  4. Отпадает необходимость строить калибровочные кривые. Достаточно сравнить светимость вашего образца со светимостью эталона.
  5. Становится возможным одновременно сразу несколько мишеней на одной мембране, без отмывок и повторных гибридизаций (многоцветные Вестерн-блоты).
  6. Практика показывает, что, в отличие от хемилюминесцентных блотов, флуоресцентные блоты не боятся высыхания и на долго сохраняют свою активность, что может быть крайне полезно, в некоторых случаях.

Однако, при работе с флуоресцентными красителями, для получения качественного результата, нужно следующие моменты:

  1. Качество источника возбуждения. Чем сильнее источник света, чем уже выдаваемый им спектр длин волн и чем лучше данный спектр соответствует спектру поглощений флуорофора (чем меньше энергии попадает в зону эмиссии флуорофора) – тем лучше, четче сигнал.
    Качество источника возбуждения
  2. Кроме того, разнообразные сопутствующие материалы (мембраны и пластмассы) могут давать высокий фон в видимой области спектра, за счет автофлуоресценции и светорассеяния. Таким образом, желательно работать в такой части спектра, где автофлуоресценция и светорассеяние сопутствующих материалов минимальны.

значок вниманияКомпания ЛАБИНСТРУМЕНТЫ представляет Вашему вниманию продукцию компании LI-COR Biosciences (США).

Компания LI-COR является мировым лидером в производстве документирующих систем.

В ассортименте компании LI-COR имеются:

  • Передовые многофункциональные системы документации, работающие на принципе детекции флуоресценции в ближнем ИК-спектре, серии Odyssey;
  • Гибридные документирующие системы, позволяющие производить, как детекцию флюоресценции в ближней ИК-области, так и детекцию хемилюминесцентного сигнала, из той же серии;
  • Системы для in vivo визуализации процессов протекающих в организме мелкого животного, работающие на принципе детекции флуоресценции в ближней ИК-области и биолюминесценции – Pearl Trilogy;
  • Компактные сканеры C-DiGit для оцифровки классических хемилюминесцентных Вестерн-блотов, по приемлемой цене.
  • А также широкий перечень различных реагентов для блотинга и in vivo имиджинга.

В системах производства компании LI-COR Biosciences все рассмотренные выше моменты учтены и доведены до совершенства.

  • Во всех системах серии Odyssey для возбуждения флуоресценции используются твердотельные лазерные диоды.
  • Для работы выбран диапазон ближнего ИК-спектра 680 - 820 нм, в пределах которого показатели поглощения, автофлуоресценции и светорассеяния для воды, большей части биологических объектов, а также пластиков и мембран – минимальны.
  • Возбуждение и детекция флуоресценции идут параллельно по двум независимым каналам (700 и 800 нм), что позволяет одновременно детектировать несколько мишеней в одном образце.
  • Сигналы не перекрываются и не оказывают влияния друг на друга. Одновременно с высочайшим разрешением можно детектировать как очень сильные, так и очень слабые сигналы.
    Детекция сигналов

Все это, наряду с передовым программным обеспечением Image Studio позволяет добиться поистине феноминальной четкости изображений и точности количественного анализа.

Краткое описание технических характеристик и функционала систем серии Odyssey:

Тип системы /

приложение

ODYSSEY DLx

Гибкая, универсальная и мощная система


ODYSSEY XF

Гибридная система (ИК-флуоресценция + хемилюминесценция)

Максимальная область сканирования

25 см x 25 см


10 см x 12 см

Разрешение

21-337 мкм


125 мкм

Источник возбуждения

Точечный лазер


Равномерное по всему объему освещение лазерным пучком

Метод определения

Лавинный фотодиод


CCD

Динамический диапазон

4 порядка (ручной режим)

> 6 порядков (AutoScan)


> 6 порядков

Документация инфракрасных Вестерн-блотов

+


+

Детекция хемилюминесценции

-


+

Документация гелей с окрашиванием по Кумасси

+


+

Детекция продуктов окрашенных Syto 60

+


+

Детекция нуклеиновых кислот окрашенных этидиум бромидом

-


+

Детекция нуклеиновых кислот окрашенных семейством красителей SYBR®

-


+

Анализ In-Cell вестернов

+


-

Анализ On-Cell вестернов

+


-

Анализ белковых микрочипов

+


-

EMSA

+


-

Получение изображений тканевых срезов

+


-

Получение изображений целых органов

+


-

Получение изображений малых животных

+


-

ELISA, FLISA

+


-

LI-COR C-DiGit

значок внимания

Если же вам не требуется столь широкий функционал и точный количественный анализ Вестерн-блотов и вас полностью устраивает хемилюминесценция, но, при этом, вы хотели бы отказаться от использования фотопленки и специальной фотолаборатории, можем вам предложить портативный планшетный сканер C-DiGit, производства компании LI-COR.

Данный сканер специально разработан для получения высококачественных изображений хелилюминесцентных вестерн-блотов в цифровом формате.

Блот-сканер LI-COR C-DiGit

Блот-сканер C-DiGit от компании LI-COR представляет собой компактное, предварительно настроенное, готовое к использованию, высокопроизводительное и высокочувствительное сканирующее устройство, предназначенное для детекции хемилюминесцентных вестерн-блотов.

Компактный дизайн блот-сканера позволяет разместить его прямо на рабочем столе, например как вортекс или микро-центрифугу.

Отсутствие необходимости в предварительных настройках и функция сканирования «одной кнопкой» позволяют легко и быстро начать использовать прибор и получать высококлассные изображения, а интуитивно понятный интерфейс программного обеспечения LI-COR Image Studio дает возможность быстро и эффективно провести анализ полученных результатов.

Принцип сканирования позволяет избежать взаимовлияния сигналов.

Файлы изображения, полученные с помощью блот-сканера C-DiGit, содержат полный диапазон данных хемилюминесценции.

За один «прогон» вы получаете высококачественные изображения как самых интенсивных, так и самых слабых сигналов.

Дружественное к пользователю программное обеспечение Image Studio, поставляемое в комплекте с блот-сканером C-DiGit, представляет собой мощный и простой в использовании инструмент для анализа изображений вестерн-блотов.

При этом, блот-сканер C-DiGit позволяет избежать трудоемкого процесса проявки пленки и оптимизировать затраты лаборатории, исключив затраты на специальную фотографическую пленку, дорогостоящие реагенты и содержание фотолаборатории.

Блот-сканер C-DiGit от компании LI-COR является прибором, сочетающим в себе удобство в работе, отличную функциональность и привлекательную цену.

значок внимания

Продукция компании отличается передовыми техническими характеристиками, высокой надежностью, пользовательски-ориентированным и интуитивно понятным интерфейсом и прекрасным соотношением "цена-качество-функциональность". Компания LI-COR осуществляет непрерывную поддержку всего своего оборудования. Нет необходимости каждый раз приобретать что-то новое, т.к. с помощью разнообразных наборов аппаратной модификации выпускаемых компанией LI-COR ваше оборудование сможет долго оставаться на самом передовом крае технологий.

значок внимания

По всем взаимосвязанным вопросам, пожалуйста, обращайтесь к ответственным менеджерам компании «ЛАБИНСТРУМЕНТЫ».

Посмотреть товары в каталоге

Комментарии

Пока никто не оставлял здесь записей.

Новый комментарий
 

Случайные статьи

Хотите получать информацию
о наших новинках, спецпредложениях и новостях?